Microscopia Básica

 

A curiosidade humana e o fantástico mundo científico apresentaram, dentre inúmeras outras descobertas, o microscópio, aparelho capaz de aumentar a imagem de pequenos objetos.

O crédito por essa incrível invenção foi dado, em 1591, aos holandeses Hans Janssen e seu filho Zacarias, fabricantes de óculos. Eles ampliavam as imagens e observavam objetos muito pequenos por meio de duas lentes de vidro montadas nas extremidades de um tubo.

No Séc. XVII foram  desenvolvidos Instrumentos óticos dotados de lentes objetiva e ocular, que permitem maior ampliação na imagem.

Posteriormente, o holandês Antonie van Leewenhoek (1632 - 1723) desenvolve uma lupa com a qual estuda vários microorganismos e células (Séc. XVII).

Com essas descobertas, Robert Hooke (1635 - 1703), desenvolveu um aparelho com duas lentes ajustadas nas extremidades de um tubo de metal. E por possuir duas lentes, a ocular e a objetiva, ficou conhecido como microscópio composto. realizou a descoberta da estrutura. As estruturas das células foram descobertas por Hooke, em 1665, quando observava cortes de cortiça.

Assim, o microscópio, foi inventado para aumentar ou ampliar imagens de objetos não visíveis a olho nu. O poder de resolução dos microscópios mais comuns que usamos em laboratórios é cerca de mil vezes mais que o olho humano.

A ampliação, um aumento aparente no tamanho, é geralmente considerada como a principal função de um microscópio .

Os fatores fundamentais, envolvidos  na ampliação e na resolução das imagens que vemos em microscópios são a luz e as lentes utilizadas.

Os microscópios dividem-se em duas categorias principais:

Microscópio óptico: é formado por duas lentes, a objetiva e a ocular, quando se observa através da lente ocular é vista uma imagem virtual aumentada da imagem real.

Microscópio eletrônico: permitem o estudo mais detalhado da estrutura interna da célula, podendo proporcionar aumentos de 5 mil e 100 mil vezes, em vez de luz, um feixe de elétrons que atravessa o material biológico, produzindo a imagem, observada numa tela

Há ainda os microscópios de varredura de ponta que trabalham com uma larga variedades de efeitos físicos (mecânicos, ópticos, magnéticos, elétricos).

Um tipo especial de microscópio eletrônico de varredura é por tunelamento, capaz de oferecer aumentos de até cem milhões de vezes, possibilitando até mesmo a observação da superfície de algumas macromoléculas, como é o caso do DNA.

As diferentes técnicas utilizadas em microscopia dependem também das finalidades laboratoriais. Por exemplo, se as lâminas forem para fins educacionais, deve-se tentar montar uma lâmina permanente, no entanto, se a lâmina for preparada para testes laboratoriais na área de saúde, como contagem de células, tal técnica deve ser descartada, seguindo as normas de biossegurança necessárias.

 

Como focalizar a amostra e observar no microscópio óptico

Ligue o microscópio. Posicione a lâmina sobre a platina e prenda com a pinça.

Para iniciar, use a menor ampliação. Ajuste o revólver para que a lente objetiva de menor aumento esteja no lugar correto.

Aproxime a lâmina da objetiva pelo dispositivo macrométrico até perceber o foco.

Ajuste a intensidade da luz de acordo com a objetiva utilizada.

Utilize o dispositivo micrométrico para dar nitidez à imagem.

Para aumentar a ampliação, gire o revólver e selecione a próxima lente objetiva.

Ajuste novamente a intensidade da luz e a nitidez.

Lembre se que o foco varia, portanto o que pode estar nítido para você pode não estar para outra pessoa.

 

Componentes de um microscópio

 

■ Lente ocular → lente que o visualizador examina para ver a amostra. A ocular geralmente contém um aumento de 10x ou 15x.

■ Ajuste de dioptria → ferramenta útil para mudar o foco da ocular e corrigir qualquer diferença de visão entre os dois olhos.

■ Tubo → parte que conecta a ocular às lentes objetivas.

■ Estativa, braço ou coluna → parte que conecta o tubo à base do microscópio.

■ Dispositivo macrométrico → estabelece um foco geral para a amostra analisada.

■ Dispositivo micrométrico → estabelece um foco mais preciso e aumenta o detalhe da amostra analisada.

■ Revólver → torre rotativa que contém as lentes objetivas. O visualizador gira para selecionar diferentes lentes objetivas.

■ Lentes objetivas → lentes mais importantes de um microscópio óptico, com aumento de 4x até 100x.

■ Mesa ou Platina → plataforma plana onde a lâmina é colocada.

■ Pinça → parte metálica que mantém a lâmina presa.

■ Charriot → botões que movem a platina para a esquerda e direita ou para cima e para baixo.

■ Interruptor → chave na base do microscópio que liga ou desliga o iluminador.

■ Iluminação → fonte de luz para um microscópio, geralmente uma lâmpada de baixa voltagem.

■ Diafragma → ajusta a quantidade de luz que atinge a amostra analisada.

■ Condensador → reúne e concentra a luz do iluminador sobre a amostra que está sendo visualizada.

■ Base → parte que suporta o microscópio e onde a fonte de iluminação está localizada.

Microbiota Normal do Corpo Humano e suas Funções

 

O ser humano no período fetal vive em um ambiente estéril e protegido, mas assim que nasce, fica exposto a microorganismos que passam a colonizar seu organismo de maneira equilibrada, cada região com suas características, que dependem da temperatura, umidade,substâncias inibitórias e nutrientes do local.

A flora de microorganismos dentro e sobre o corpo humano está submetida a constantes mudanças.Fatores como a idade, alimentação,higiene, regulação hormonal podem alterar o balanço desses microorganismos.

Os microrganismos que sempre estão em determinada região do nosso corpo, ali permanecem de forma comensal, ou seja, ambos estão sendo beneficiados.Possuem importante função de proteção e defesa do organismo na tentativa de colonização de patógenos, estimulação do sistema imune em recém-natos, além de auxiliar na absorção de nutrientes.O número de bactérias chega a ultrapassar em dez vezes o número de células do corpo humano.

Os órgãos que possuem mais contato com o ambiente externo são os mais ricos em microbiota.As cavidades geralmente são estéreis, como a cavidade peritoneal.

Existem dois tipos de microbiota:

a) Microbiota residente:microorganismos que se encontram em grande quantidade em um determinada região anatômica, em uma dada população.

b) Microbiota transitóri eliminada por mecanismos naturais de defesa ou por ações de limpeza como anti-sépse.

Caso a microbiota permanente esteja intacta, a microbiota transitória não causa danos e é eliminada.Porém, se os microorganismos permanentes estiverem em desequilíbrio, a microbiota transitória pode provocar doenças.Microorganismos de dada região também podem se tornar patógenos se encontrados em outro local que não o habitual.

Microbiota normal específica de cada região no organismo

1) Pele: microbiota se encontra em toda extensão, sendo mais concentrada em regiões mais quentes e úmidas, como axilas e períneo, chegando ao número de 10⁶ bactérias por cm².Geralmente predominam as bactérias Gram positivas, como Staphylococcus, Corynebacterium e Propionobacterium.

2) Vias aéreas superiores:

- Cavidade bucal, orofaringe e nasofaringe: podem ser encontrados Streptococcus, Lactobacillus, Fusobacterium, Velionella, , Neisseria, Treponema, Candida, Staphylococcus, Mycoplasma dentre outras.A  microbiota da cavidade oral tem grande importância já que doenças periodontais e até endocardites subagudas podem ser causadas por constituintes desta microbiota

- Fossas nasais:predominam Corynebacterium e Staphylococcus.

3) Vias aéreas inferiores: vias aéreas inferiores, laringe, traquéia e bronquíolos, são regiões estéreis.

4) Trato genitourinário: predominam bactérias Gram negativas.

- Vagina: população microbiana variada, devido a alterações hormonais.Recém-nascidas são colonizadas por lactobacilos nas primeiras 6  semanas.Depois, a taxa de estrogênio decai, e há colonização por estreptococos, estafilococos e enterobacterias.No início da puberdade, a alteração nas taxas de estrogênio geram novas mudanças, tendo lactobacilos predominantes.O pH também é responsável por estas mudanças, devido a quantidade de glicogênio, que ao sofrer fermentação, diminui o pH, dificultando o desenvolvimento de algumas bactérias.

- Uretra anterior: possui uma colonização variada,podendo encontrar lactobacilus, estreptococos, estafilococos, epidermidis e difteróides. Estreptococos fecalis e Candida pode também estar presente de forma transitória, assim como E. coli.

- Ureteres, bexiga e rins: não possuem microbiota residente.Cérvice geralmente não é colonizada.

5) Conjuntiva: pode ser estéril ou colonizada por Difteróides, Estafilo epidermidis e estreptococos não hemolíticos.Esta microbiota é controlada pela lágrima que contém lizosima agindo como importante bactericida.

6) Ouvido externo: possui semelhança com a microbiota da pele.

7) Trato gastrointestinal:

- Esôfago: microbiota pouco numerosa, geralmente de colonização apenas transitória.

- Estômago: devido ao pH altamente ácido, são tolerantes poucas bactérias, como Lactobacillus,  Streptococcus spp.(produtoras de ácido láctico)  e Helicobacter pylori (causadora de gastrites e úlceras).

- Intestino delgado: são mais freqüentes nesta microbiota, estafilococos, estreptococos e lactobacilos, sendo encontrados microorganismos anaeróbios. Podem ser encontrados no delgado proximal também cocos Gram positivos resistentes à acidez gástrica.Os ácidos biliares são inibidores do crescimento das bactérias in vitro.

- Íleo: aumenta a microbiota, passando a incluir também bactérias anaeróbias devido ao baixo poder de oxirredução.

- Intestino grosso: local de maior concentração de microorganismos, chegando à concentração de 10¹¹ por grama de fezes, além do aumento considerável de bactérias anaeróbias, superando as outras.Nesta microbiota normal, predomina a Eubacterium,  Bifidobacterium e Bacterióides. Todos os seres humanos também são portadores da E. coli nesta microbiota. Podem ser encontrados neste órgão também cocos Gram positivos resistentes à acidez gástrica no  delgado proximal.

Além desta distribuição vertical já descrita, há a distribuição horizontal, que é dividida em: luz, camada de muco e epitélio.A luz intestinal é a região com maior variedade microbiana comparada com a camada de muco e o epitélio.

Algumas ações são feitas pela própria flora intestinal para garantir suas características próprias:

a) E.coli inibe o crescimento bacteriano  de Shiguela e de outras bactérias por competir por fontes de carbono em locais com baixo oxigênio.;

b) Lactobacilos competem por sítios de adesão com outras bactérias, além de produzir substâncias inibidoras de crescimento para outros microorganismos da microbiota;

c) Bactérias facultativas, por seu alto consumo de oxigênio, criam condições de anaerobiose, garantindo o crescimento de anaeróbios;

d) Os subprodutos do metabolismo próprio principalmente das bactérias anaeróbias, como ácido acético,butírico e propiônico, promovem um ambiente intralumial de restrito crescimento bacteriano, contribuindo para um equilíbrio da microbiota intestinal;

e) Quorum-sensing é realizado com a produção e detecção de moléculas sinalizadores  denominadas auto-indutoras, utilizado por bactérias Gram positivas e Gram negativas.Servem como moduladores bacterianos, importantes para a formação e manutenção da flora intestinal. 

Microbiota intestinal em diferentes fases da vida

1) Recém-nascido: 

Quando amamentado com leite materno, possui maior concentração de estafilococos e bifidobactérias, e menor quantidade de clostrídeos e enterococos que crianças amamentadas com mamadeira.Também influenciam o crescimento bacteriano da mesma ou de diferentes espécies.Os lactobacilos não são influenciados pelo tipo de amamentação.

Crianças amamentadas no seio materno são menos colonizadas por Klebsiella,Enterobacter e menor quantidade de sorotipos de E.coli ( possuem menor freqüência de E.coli portadora de antígeno K1, que costuma causar meningite em recém-natos).

A microbiota da criança inicialmente deriva da microbiota fecal da mãe, que é adquirida ao passar pelo canal de parto, e tardiamente, é colonizada por bactérias que se encontram nos alimentos e do meio em que vive. Crianças nascidas por cesárea adquirem anaeróbios e enterobactérias mais tardiamente, já que não teve contato com a microbiota fecal materna. As bactérias hospitalares e dos profissionais da saúde envolvidos no nascimento também são fontes de formação da microbiota do bebê. Dessa forma, segundo estudos, há diferenças entre a microbiota normal de recém-nascidos de países desenvolvidos e subdesenvolvidos, principalmente por questões de higiene, do local de nascimento e da própria mãe.

 2) Idoso: 

Possui uma microbiota mais rica em clostrídeos e de maneira menos acentuada, em lactobacilos, coliformes e enterococos do que a microbiota adulta.As bifidobactérias se encontram em menor quantidade nos idosos, enquanto os bacterióides e eubactérias se encontram na mesma proporção em ambas as faixas etárias.

Referências bibliográficas

ALTERTHUM, F.; TRABULSI, L. R. Microbiologia. 5ª ed. São Paulo: Atheneu. 2008

MURRAY P. R.; ROSENTHAL K. S.; KOBAYASHI G. S.; PFALLER M. A. Microbiologia médica. 5ª ed.Rio de Janeiro:Elsevier, 2006

Mutações Gênicas e Cromossômicas

As mutações são alterações na expressão individual dos genes, como também qualquer alteração que envolva o número ou a estrutura dos cromossomos, levando em consideração as células diploides normais da maioria das espécies.

Qualquer fator que aumente a probabilidade de ocorrerem mutações, é chamado de fator mutagênico. Existem vários tipos de fatores mutagênicos, sendo os mais conhecidos as radiações e certas substâncias químicas.

Químicos	Físicos
Gás mostarda Colchicina Talidomida Metais pesados	Radiação ultravioleta Raios-x Raios gama

As Mutações Gênicas são modificações na expressão de genes individuais, devido a alterações envolvendo as bases nitrogenadas do DNA. Muitas vezes, as doenças causadas por um único gene se comportam, em termos de transmissão, de acordo com as leis de Mendel.

Mutação	Características
Fenilcetonúria	Metabolismo anômalo da fenilalanina (deficiência mental, pele clara)
Doença de Huntington	Perda de memória, movimentos incontroláveis, morte
Anemia falciforme	Produção de hemoglobina anormal
Albinismo	Ausência parcial ou total de melanina
Fibrose cística	Produção de muco anormalmente espesso
Doença de Tay-Sachs	Degeneração nervosa progressiva e mortal

As Mutações Cromossômicas envolvem alterações na estrutura ou na quantidade dos cromossomos.

Zigoto	Aneuploidia	Nome clínico
47, XXX	Trissomia	Síndrome do triplo X
47, XXY	Trissomia	Síndrome de Klinefelter
47, XYY	Trissomia	Síndrome do duplo Y
45, XO	Monossomia	Síndrome de Turner
45, YO	Monossomia	Síndrome do Y inviável
47,XX*(+21)	Trissomia	Síndrome de Down (+21)
47,XX*(+18)	Trissomia	Síndrome de Edwards (+18)
47,XX*(+13)	Trissomia	Síndrome de Patau (+13)

As mutações cromossômicas são causadas por:

• defeitos na estrutura dos cromossomos (mutações estruturais);
• variação no número dos cromossomos das células de um indivíduo (mutações numéricas).

Entre as mutações estruturais citamos: síndrome de cri-du-chat ou do miado do gato e a síndrome de duplicação.

• Síndrome do miado do gato: o choro dos bebês lembra o miado do gato; apresentam microcefalia (cabeça pequena), nariz achatado (em sela); face alargada; retardo mental, motor e de crescimento. As pessoas afetadas morrem nos primeiros meses de vida ou na primeira fase da infância. A síndrome decorre da deficiência de um segmento do cromossomo 5.
• Síndrome da duplicação: o bebê apresenta crânio em forma de cone; veias proeminentes no couro cabeludo; sobrancelhas salientes; pêlos faciais; glaucoma (endurecimento do globo ocular); nariz curto; orelhas implantadas abaixo da posição normal; membros e pescoço curtos; deformações nos pés. É uma mutação no cromossomo 3, onde ocorre a deficiência em um cromossomo 3 e a duplicação do outro cromossomo 3 que recebeu o segmento do seu homólogo.

Entre os tipos de mutações numéricas mais comuns nas populações, encontramos as aneuploidias, que provocam alterações no patrimônio genético dos homens (44A + XY) e das mulheres (44A + XX), podendo ser:

• autossômica (alteração dos cromossomos autossomos).
• sexual (alteração do par sexual).

As aneuploidias caracterizam-se pela variação de um ou mais cromossomos no cariótipo do indivíduo, resultante da não-disjunção de certos pares de homólogos durante a gametogênese.

• Na perda de um cromossomo, a aneuploidia é do tipo monossomia (2n – 1). 
• No acréscimo de um cromossomo, tem-se a trissomia (2n + 1).

Entre as mutações sexuais, podemos citar: síndrome de Klinefelter, síndrome de Turner e síndrome do triplo X, entre outras.

• Síndrome do triplo X: mulheres que podem ser normais e férteis ou, eventualmente, ter retardo mental.
• Síndrome de Klinefelter: homens que apresentam grande estatura, um fenótipo masculino, testículos atrofiados, deficiência mental, pequenos seios, etc.
• Síndrome do duplo Y: homens fenotipicamente normais e férteis, geralmente de grande estatura.
• Síndrome de Turner: fenótipo feminino, ovários atrofiados, ausência de mamas, ombros largos, pescoço curto e grosso e estatura baixa.

Como exemplos de mutações autossômicas, temos: síndrome de Down, síndrome de Edwards e síndrome de Patau.

• Síndrome de Down ou trissomia do 21: foi descrita pelo médico inglês J. Langdon Down. Essa anomalia pode ocorrer tanto em homens como em mulheres, cujos cariótipos serão, respectivamente: 45A + XY e 45A + XX. Os indivíduos apresentam microcefalia, nariz pequeno, retardo mental, prega transversal contínua na palma da mão, prega típica no canto dos olhos (epicântica) que sugere olhos de oriental, mãos curtas e largas, ausência de uma falange com prega única no dedo mínimo, dentição irregular, língua fissurada, boca quase sempre aberta com protusão da língua,  adiposidade, etc.
• Síndrome de Edwards ou trissomia do 18: descrita por Edwards e colaboradores. Caracteriza-se por malformações múltiplas como maxilar inferior retraído; dedos flexionados (cerrados); defeitos cardíacos; deformidades do crânio, da face e dos pés; grave retardo mental; podendo apresentar também lábio leporino e palato fendido. A morte ocorre geralmente em cerca de 3 a 4 meses de idade.
• Síndrome de Patau ou trissomia do 13: descrita por Patau e colaboradores. O portador apresenta polidactilia; defeito cardíaco e de vários órgãos internos (rins, intestinos); lábio leporino e palato fendido. As crianças que chegam a nascer não ultrapassam os três anos de idade.

Como prevenir?

Muitas tentativas têm sido feitas para detectar precocemente algumas anomalias genéticas. Além das técnicas de aconselhamento genético, temos exames preventivos que são realizados na fase intra-uterina, como a amniocentese.

O aconselhamento genético consiste em transmitir ao casal as informações necessárias sobre os aspectos de malformações que podem ocorrer no recém-nascido. O aconselhamento indica a probabilidade esperada de ocorrer determinadas malformações.

A amniocentese é um exame no qual se recolhe o líquido amniótico para análise das células que se descamam do corpo do embrião, para se estudar o cariótipo.                                             

Os perigos de um bom bronzeado

A radiação ultravioleta é capaz de alterar a seqüência de bases nitrogenadas da molécula de DNA. Com a alteração na camada de ozônio, a incidência da radiação ultravioleta sobre a Terra, tende a aumentar, elevando o número de casos de câncer de pele.

Em resumo :

As Anomalias Cromossômicas Numéricas podem ser do tipo aneuploidia ou euploidia.

As aneuploidias não envolvem o genoma inteiro. Pode ocorrer o acréscimo ou redução de cromossomos.

• Nulissomia      2n – 2
• Monossomia    2n – 1
• Trissomia        2n + 1
• Tetrassomia    2n + 2

As euploidias envolvem o genoma inteiro.

• Haploidia          n
• Triploidia        3n
• Tetraploidia    4n
• Hexaploidia    6n

As Anomalias Cromossômicas Estruturais ocorrem por:

• Deficiência – Falta um pedaço de cromossomo
• Duplicação – Repetição de um segmento do cromossomo
• Inversão – Rotação de 180^O de um segmento do cromossomo
• Translocação - Transferência ou troca de pedaço com cromossomo não-homólogo

As mitocôndrias e o reprocessamento de energia na célula - 1 grau

As mitocôndrias apresentam duas membranas: uma externa (lisa) e uma interna (pregueada, formando as cristas mitocondriais). Elas extraem a energia acumulada nas moléculas orgânicas formadas na fotossíntese, guardando-a em moléculas de ATP, no processo chamado de respiração.

A respiração pode ser aeróbia ou anaeróbia.

A respiração aeróbia é uma seqüência de reações de degradação das moléculas orgânicas, visando à liberação da energia nelas contidas, afim de guardá-las em moléculas de ATP, com a participação do oxigênio molecular (O₂).

Acontece em três etapas: glicólise, ciclo de Krebs e cadeia respiratória.

• A glicólise acontece no citoplasma
• O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial
• A cadeia respiratória nas cristas mitocondriais. Durante o processo são utilizados a glicose ou outros metabólitos, o O₂ e ADP, resultando na formação de CO₂, H₂O e 38 moléculas de ATP.

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ --> 6CO₂ + 6H₂O + ENERGIA

A respiração anaeróbia é uma forma de obtenção de energia pela oxidação de compostos orgânicos, porém com a utilização de substâncias inorgânicas como nitratos, sulfatos ou carbonatos no lugar do oxigênio. O ganho energético é inferior ao da respiração aeróbia. Ocorre em microorganismos como as bactérias denitrificantes do solo, as leveduras, etc.

O principal tipo é a fermentação que pode ser alcoólica, lática ou acética.

A fermentação é uma modalidade de respiração anaeróbia em que os íons hidrogênio liberados não são recolhidos nem pelo oxigênio (r. aeróbia) nem pelos compostos inorgânicos, mas sim pelos próprios subprodutos da degradação da glicose, como o ácido pirúvico.

• Na fermentação alcoólica, o ácido pirúvico dá como produtos finais o álcool etílico e CO₂.
• Na fermentação lática, o ácido pirúvico se transforma em ácido lático.
• Na fermentação acética, o ácido pirúvico forma ácido acético e CO₂.

Os cloroplastos e o processo de fotossíntese - 1 grau

Os cloroplastos são ricos em clorofila e são responsáveis pela fotossíntese. O seu número é variável de célula para célula. Apresentam duas membranas, uma externa (lisa) e uma interna (pregueada, formando lamelas). Possuem DNA e são capazes de auto-reprodução.

A fotossíntese é o fenômeno pelo qual os organismos clorofilados retêm a energia da luz e a utilizam na reação entre o CO₂ e a água para obtenção de glicose (matéria orgânica), com liberação de O₂ para o meio. A fotossíntese representa uma fonte permanente de matéria orgânica que é usada como alimento por todos os seres heterotróficos, como também possibilita a renovação constante do ar atmosférico, retirando o gás carbônico e liberando o oxigênio.

6CO₂ + 12H₂O --> C₆H₁₂O₆ + 6H₂O + 6O₂

A fotossíntese compreende duas etapas: a fase luminosa e a fase escura.

A fase luminosa exige a participação da luz para a formação de ATP (adenosina trifosfato) e fotólise da água (rompimento da molécula de água com liberação de oxigênio).

Encerrada a primeira fase, tem prosseguimento a segunda, mesmo na ausência de luz, daí a denominação de fase escura.